ProTox 3.0: Kimyasal Bileşikler için Yeni Nesil Toksisite Tahmini

In silico toksisite modelleri, kimyasalların toksik etkilerini tahmin etmeye yönelik mevcut in vitro toksisite yöntemlerini desteklemeyi amaçlamaktadır. Bu sayede hayvan testlerine duyulan gereksinim, zaman kaybı ve maliyetler en aza indirilmektedir. Bu modeller; toksikoloji, biyoistatistik, sistem biyolojisi, bilgisayar bilimi ve diğer birçok disiplinin birleşiminden oluşan kapsamlı bir bilgi altyapısına sahiptir (1). Bir kimyasalın toksisite düzeyi, mutajenite ve kanserojenlik gibi faktörler göz önünde bulundurularak değerlendirilebilir. Ayrıca, belirli hücre türlerine yönelik analizler veya sitotoksisite, immünotoksisite ve hepatotoksisite gibi spesifik endikasyon alanları baz alınarak, LD50 (test edilen popülasyonun %50’sinin ölümüne neden olan doz) gibi niceliksel ya da aktif/inaktif şeklinde niteliksel yöntemlerle de ölçülebilir (2). In siliko toksisite alanında önemli bir gelişme olarak, kemirgen akut toksisite tahmin platformu, deneysel araştırmacılar ve hesaplamalı toksikologlar başta olmak üzere geniş bir kullanıcı kitlesine sunulmak amacıyla geliştirilmiş ve 2014 yılında kemirgen oral toksisite tahmini için ProTox: Web Sunucusu yayımlanmıştır (3).

ProTox 3.0 web sunucusu, mevcut hesaplamalı modellere kıyasla çeşitli avantajlar sunmaktadır. ProTox web sunucusu; kimyasal, moleküler hedef bilgisi, metabolizma ve Advers Sonuç Yolları (AOP'ler) gibi bileşenleri içermektedir. ProTox web sunucusunun yeniliklerinden biri, tahmin şemasının farklı toksisite seviyelerine göre sınıflandırılmasıdır. Bu seviyeler arasında oral toksisite, organ toksisitesi (hepatotoksisite, nörotoksisite, solunum toksisitesi, kardiyotoksisite ve nefrotoksisite), toksikolojik sonlanım noktaları (endpoints) (mutajenite, kanserojenite, sitotoksisite, immünotoksisite, BBB (kan beyin bariyeri) geçirgenliği, ekotoksisite, klinik toksisite ve besinsel toksisite, 12 toksikolojik yolak (AOP), 15 toksisite hedefi, 14 moleküler başlatıcı olay (MIE) hedefi ve metabolizma ile ilişkili 6 moleküler hedef bulunmaktadır. Bu sayede, toksik yanıta neden olan olası moleküler mekanizmalar hakkında içgörü sağlanmaktadır. En son sürüm olan ProTox 3.0, moleküler benzerlik, farmakofor tabanlı yaklaşımlar, fragment eğilimleri ve makine öğrenmesi modellerini içeren çeşitli toksisite sonlanım noktalarının tahmini için geliştirilmiştir. 61 model içeren ProTox 3.0, en kapsamlı toksikolojik sonlanım noktalarını tahmin etmeye olanak tanıyan, ücretsiz erişilebilen bir hesaplamalı toksisite tahmin web sunucusudur (4). ProTox 3.0 web sunucusuna https://tox.charite.de/protox3/ sitesi üzerinden ulaşılabilmektedir.

Örnek uygulamamızda albuterol ve aflatoxin B1 molekülleri kullanılarak toksisite tahmini yapılacaktır. Albuterol (veya salbutamol, Amerika Birleşik Devletleri dışında bilindiği şekliyle), astım için en yaygın olarak kullanılan β2-agonisti olup, akut astım alevlenmeleri ve semptomları için kurtarma tedavisi olarak tercih edilen etkinlik, güvenlik ve seçicilik profiline sahiptir (5). Aflatoksin B1 (AFB1) sık görülen ve en zararlı toksinler arasındadır. Kanserojenliği ve bağışıklık sistemini baskılama kapasitesi tavuklar, alabalıklar, sığırlar ve fareler dahil olmak üzere çeşitli hayvan türlerinde yaygın şekilde rapor edilmiştir (6).

1.Adım: Yukarıda belirtilen siteden ProTox 3.0 web sunucusunun ana sayfasına gidilir ve sayfanın üst kısmında yer alan 'Tox Prediction' sekmesine tıklanır.

Şekil 1. ProTox 3.0 web sunucusu ana sayfası.

Analiz için girdi olarak; moleküllerin PubChem isimleri, Canonical SMILES formatı veya molekülün 2 boyutlu yapısı çizilerek molekül yapısı sunucuya tanıtabilir. Uygulamada iki molekül için de Canonical SMILES formatlarını kullanarak işlem yapacağız.

2. Adım: Moleküllerin Canonical SMILES formatlarını elde etmek için PubChem sitesi kullanılabilir. PubChem sitesine https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ‘den ulaşılabilir. Öncelikle arama kısmına “albuterol” yazılır ve PubChem CID numarası 2083 olan molekül seçilir.

Şekil 2. Albuterol molekülünün PubChem veri tabanındaki bilgileri.

Sayfaki Names and Identifiers bölümü altından Canonical SMILES kısmında CN1C2CCC1CC(C2)OC(=O)C(CO)C3=CC=CC=C3 şeklinde yer alan format kopyalanır.

Şekil 3. Albuterol molekülüne ait Canonical SMILES formatı.

3. Adım: Kopyalanan albuterol molekülüne ait Canonical SMILES formatı, ProTox 3.0 web sunucusundaki giriş alanına yapıştırılır ve 'smiles' butonuna basılır. Daha sonra, alt sekmede tahmin edilmesi istenen toksisite parametreleri ve yolaklar seçilir. Tüm parametrelerin incelenmesi için 'All' seçeneği kullanılabilir. Bu uygulamada her molekül için tüm parametrelerin tahminini yapacağımızdan, 'All' seçeneğine tıklanır."

Şekil 4. Albuterol molekülüne ait sonuç ekranı.

4. Adım: Ardından Start Tox-Prediction butonuna basılır ve sonuçlar beklenir. (Analiz yaklaşık 1 dk sürmektedir)

Şekil 5. Albuterol molekülüne ait LD50, toksisite sınıfı ve moleküler özelliklerinin tahmin sonuçları.

Sonuç sayfasının üst kısmında molekülün 2 boyutlu gösterimi, LD50 değerinin tahmini dozu, toksisite sınıfının tahmini, molekül ağırlığı, Hidrojen bağı alıcı (acceptor) ve verici (donor) sayısı, atom sayısı, bağ sayısı, dönebilen bağ sayısı, moleküler kırılma (refractivity) değeri, topolojik polar yüzey alanı değeri ve LogP değeri gibi parametreler yer almaktadır. Albuterol molekülü için tahmin edilen LD50 değeri 660 mg/kg ve toksisite sınıfı ise 4’tür. Toksisite sınıf değeri 1’den 6’ya gittikçe zarar vericilik potansiyeli azalmaktadır.

Şekil 7. Albuterol molekülüne ait toksisite parametrelerinin tahmin sonuçları.

Sonuç sayfasının alt kısmında ise toksisiteye ait tahminler yer almaktadır. Sonuçlarda değerlerin “Inactive” olması toksisiteye yol açmadığını “Active” ise yol açtığını göstermektedir. Ayrıca Probability değeri 1’e ne kadar yakınsa yapılan tahminin o derece doğruya yakın olduğu gösterilmektedir. Albuterol molekülüne ait bu sonuçta, çoğu toksisite parametreleri için inaktif olduğu görülmektedir yani bu istediğimiz bir durumdur. Ve yapılan tahminler de genel olarak 1 değerine yakındır.

5.Adım: Aynı adım aflatoxin B1 molekülü için de yapılır. Aflatoxin B1 için PubChem CID numarası 186907 olan molekül kullanılır. Canonical SMILES formatı elde edilip ve aynı basamaklar gerçekleştirilip analizler yapıldığında aşağıdaki sonuçlar elde edilmektedir.

Şekil 8. Aflatoxin B1 molekülüne ait LD50, toksisite sınıfı ve moleküler özelliklerinin tahmin sonuçları.

Aflatoxin B1 molekülünün tahmin edilen LD50 değeri 3 mg/kg ve toksisite sınıfı 1’dir. Bu değer aflatoxin B1’in çok tehlikeli ve toksik bir molekül sınıfına ait olduğunu göstermektedir.

Şekil 9. Aflatoxin B1 molekülüne ait toksisite parametrelerinin tahmin sonuçları.

Aflatoxin B1 molekülünün toksisite parametrelerinin tahmini incelendiğinde; nefrotoksik, solunum için toksik, karsinojenik, immünotoksik ve mutajenik olduğu görülmektedir. Ayrıca kan beyin bariyerinden geçememesi (BBB) ve besinsel toksisite gibi özellikleri de aktif olarak belirlenmiştir.

ProTox 3.0 web sunucusu, kapsamlı toksisite tahmin modelleri ve makine öğrenmesi tabanlı yaklaşımları ile kimyasal bileşiklerin olası toksik etkilerini değerlendirmek için güçlü bir araç sunmaktadır. Moleküler benzerlik, farmakofor tabanlı analizler ve toksisite ile ilişkili biyolojik yolakları içeren gelişmiş algoritmaları sayesinde, araştırmacılara daha güvenilir ve ayrıntılı tahminler sağlamaktadır. Organ ve sistem toksisitelerinden, metabolik yolaklara kadar geniş bir perspektifte analiz yapabilme yeteneği, ilacın güvenliği ve çevresel toksisite değerlendirmeleri için kritik bir avantaj sunmaktadır. Kullanıcı dostu arayüzü ve ücretsiz erişim imkânı ile ProTox 3.0, ilaç keşfi, kimyasal güvenlik değerlendirmesi ve toksikoloji araştırmalarında önemli bir kaynak olmaya devam etmektedir.

REFERANSLAR

1. Zhang, L., McHale, C. M., Greene, N., Snyder, R. D., Rich, I. N., Aardema, M. J., Roy, S., Pfuhler, S., & Venkatactahalam, S. (2014). Emerging approaches in predictive toxicology. Environmental and molecular mutagenesis, 55(9), 679–688. https://doi.org/10.1002/em.21885

2. Raies, A. B., & Bajic, V. B. (2016). In silico toxicology: computational methods for the prediction of chemical toxicity. Wiley interdisciplinary reviews. Computational molecular science, 6(2), 147–172. https://doi.org/10.1002/wcms.1240

3. Drwal, M. N., Banerjee, P., Dunkel, M., Wettig, M. R., & Preissner, R. (2014). ProTox: a web server for the in silico prediction of rodent oral toxicity. Nucleic acids research, 42(Web Server issue), W53–W58. https://doi.org/10.1093/nar/gku401

4. Banerjee, P., Kemmler, E., Dunkel, M., & Preissner, R. (2024). ProTox 3.0: a webserver for the prediction of toxicity of chemicals. Nucleic acids research, 52(W1), W513–W520. https://doi.org/10.1093/nar/gkae303 

5. Ameredes, B. T., & Calhoun, W. J. (2009). Levalbuterol versus albuterol. Current allergy and asthma reports, 9(5), 401–409. https://doi.org/10.1007/s11882-009-0058-6

6. Marchese, S., Polo, A., Ariano, A., Velotto, S., Costantini, S., & Severino, L. (2018). Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development. Toxins, 10(6), 214. https://doi.org/10.3390/toxins10060214