DNA Dizileme Yöntemleri

DNA dizileme, genetik bilgiyi anlamak ve biyolojik süreçleri çözmek için kullanılan temel bir tekniktir. Genetik araştırmalardan klinik teşhislere kadar geniş bir kullanım alanına sahiptir. Bu yazıda, DNA dizileme yöntemlerini detaylı şekilde ele alacağız.

1. Sanger Dizileme

Sanger dizileme, 1977'de Frederick Sanger tarafından geliştirilen ve uzun yıllar boyunca altın standart olarak kabul edilen bir yöntemdir. Bu yöntem, zincir sonlandırma tekniğine dayanmaktadır. Sanger yöntemi için kalıp DNA (tek veya çift sarmallı DNA), primer DNA, DNA polimeraz enzimi, deoksinükleotid trifosfatlar (dNTP'ler) ve di-deoksinükleotidtrifosfatlar (ddNTP'ler) gerekir. 

İlk olarak, DNA örneği çoğaltılarak dizileme için yeterli miktara ulaşması sağlanır. Bu işlem genellikle polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak gerçekleştirilir. PCR işlemi, belirli DNA bölgelerini çoğaltmaya yarayan bir tekniktir ve süreç boyunca ısı değişimleri ile DNA'nın denatüre olması (iki sarmalın açılması), primerlerin bağlanması ve DNA polimeraz aracılığıyla yeni zincirlerin sentezlenmesi sağlanır. Dizileme işlemi için DNA’nın belirli bir bölgesine bağlanacak primer DNA eklenir. Primer, DNA sentezinin başlayabilmesi için gereklidir ve hedef dizinin başlangıç noktasını belirler. Primer bağlandıktan sonra, DNA polimeraz enzimi devreye girer ve sentez başlar. dNTP'ler, DNA'nın temel yapı taşlarını oluşturan deoksinükleotid molekülleridir (dATP, dGTP, dTTP, dCTP). DNA polimeraz enzimi, DNA sentezi sırasında dNTP'leri kullanarak yeni bir DNA zinciri oluşturur. dNTP'lerin 3' hidroksil (-OH) grubu bulunur ve bu grup, yeni gelen nükleotid ile fosfodiester bağının oluşmasını sağlar. Böylece DNA sentezi devam edebilir.

Dizileme sürecinde özel olarak modifiye edilmiş ddNTP'ler eklenir. ddNTP'lerin 3' hidroksil (-OH) grubu yoktur ve bu nedenle eklendiklerinde DNA sentezi durur. Bu mekanizma, DNA'nın farklı uzunluklarda fragmanlara ayrılmasını sağlar. Her bir ddNTP, belirli bir baz ile eşleşerek rastgele sonlanmalara neden olur. Reaksiyon tamamlandığında, oluşan DNA parçaları jel elektroforezi veya kapiler elektroforez ile boyutlarına göre ayrıştırılır. Floresan etiketli ddNTP'ler sayesinde her zincirin hangi baz ile sonlandığı belirlenir ve bir lazer okuyucu aracılığıyla DNA dizisi analiz edilir (1).

Sanger Dizilemenin Avantajları

• DNA polimerazın güvenilir sentez mekanizması sayesinde yüksek doğruluk sağlar.

• Uzun okuma uzunlukları (~800-1000 baz çifti) sağlar.

• Belirli sekansları yüksek hassasiyetle tespit edebilir.

• Verilerin işlenmesi ve yorumlanması kolaydır.

Sanger Dizilemenin Dezavantajları

1. Kimyasal reaktiflerin ve özel ekipmanların kullanımı nedeniyle diğer dizileme yöntemlerine göre daha pahalı olabilir.

2. Aynı anda yalnızca sınırlı sayıda DNA dizisi dizilenebilir bu da yüksek hacimli genom çalışmalarında dezavantaj yaratmaktadır.

3. İnsan gibi büyük genomlara sahip organizmaların dizilenmesi uzun zaman alır.

   

   Şekil 1. Sanger Yöntemi (2).

   2. Maxam-Gilbert Dizilemesi

   Maxam-Gilbert dizilemesi, 1977 yılında Sanger dizilemesine bir alternatif olarak geliştirilmiştir ancak zaman içinde karmaşıklığı ve tehlikeli kimyasallar içermesi nedeniyle daha az tercih edilir hâle gelmiştir. 

   Maxam-Gilbert dizileme işlemi başlamadan önce, DNA molekülünün 5' veya 3' ucuna radyoaktif olarak işaretlenmiş bir fosfat grubu eklenir. Bu işaretleme ile dizileme sürecinde fragmanların belirlenmesi sağlanır. Daha sonra DNA, belirli bazlara özgü kimyasal reaktifler kullanılarak kesilir. Bu kimyasallar ile belirli nükleotidleri hedef alarak DNA'nın farklı uzunluklarda fragmanlara ayrılması sağlanır. Kesilmiş DNA parçaları, poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) kullanılarak boyutlarına göre ayrılır. DNA fragmanları jelde ayrıştırıldıktan sonra, radyoaktif işaretleme sayesinde otografi yöntemi kullanılarak DNA dizisi belirlenmektedir (3).

   
   

   

   Şekil 2. Maxam-Gilbert dizileme prensibi. Tek sarmallı DNA dört farklı kimyasal reaksiyonla bazlarına ayrılır (A+G, G, C+T, C). Bu işlem, DNA'nın farklı uzunluklardaki parçalarına ayrılmasına ve poliakrilamid jelde dört ayrı kuyuda yüklenmesine neden olur. Dizilim, jelin altından üste doğru okunur (örneğin, GTATGC). Eğer bir boşluğun karşısında G bulunursa, bu 5-metilsitozin varlığını gösterir (4).

   Maxam-Gilbert Dizilemesinin Avantajları

   • Doğrudan kimyasal bazlı kesim yöntemi kullandığı için kısa DNA dizilerinde yüksek hassasiyet sağlar.

   • Tek veya çift zincirli DNA’ları dizilemek için uygulanabilir.

   • Bazlara özgü kesim mekanizması sayesinde belirli bölgelerde hassas mutasyon analizleri yapılabilir.

   Maxam-Gilbert Dizilemesinin Dezavantajları

   • Süreç çok zahmetlidir ve laboratuvar ortamında dikkatli kimyasal işlemler gerektirir.

   • Hidrazin ve radyoaktif işaretleyiciler gibi tehlikeli kimyasallar içerdiği için güvenlik riski yüksektir.

   • Sanger dizilemesi ve yeni nesil dizileme (NGS) yöntemleriyle kıyaslandığında çok daha yavaş ve maliyetli bir yöntemdir.

   • Büyük ölçekli dizileme projeleri için uygun değildir.

   
   

   3. Yeni Nesil Dizileme (NGS)

   Yeni Nesil Dizileme (Next-Generation Sequencing, NGS), DNA ve RNA’nın dizilimini hızlı, yüksek doğruluklu ve düşük maliyetli bir şekilde belirlemeye olanak tanıyan modern dizileme teknolojilerinin genel adıdır. Geleneksel Sanger dizilemesi ile karşılaştırıldığında, NGS aynı anda milyonlarca DNA fragmanını paralel olarak dizileyebilmektedir. Böylece büyük ölçekli genom projeleri, kanser araştırmaları, genetik hastalık analizleri ve metagenomik çalışmaları için devrim niteliğinde bir yöntem hâline gelmiştir. NGS, kısa okuma (short-read) ve uzun okuma (long-read) teknolojileri olarak iki ana kategoriye ayrılır. Illumina, SOLiD ve Ion Torrent gibi yöntemler kısa okuma teknolojisine dayanırken, PacBio ve Oxford Nanopore gibi yöntemler uzun okuma sağlar. Kısa okuma yöntemleri, yüksek doğruluk oranları ve düşük maliyet avantajlarıyla genellikle daha yaygın olarak kullanılırken, uzun okuma teknolojileri karmaşık genom bölgelerinin ve yapısal varyasyonların analizinde önemli avantajlar sunmaktadır. Bu teknoloji, hassas mutasyon tespiti, epigenetik modifikasyonların analizi, kanser biyolojisi çalışmaları, tek hücre (single-cell) dizilemesi ve transkriptom analizleri gibi birçok farklı biyoteknolojik ve tıbbi uygulamada kullanılmaktadır (5).

   
   

   3.1. Illumina Dizileme

   Illumina dizileme, yeni nesil dizileme (NGS) yöntemlerinden biridir ve milyonlarca DNA fragmanını aynı anda okuyarak hızlı, düşük maliyetli ve yüksek doğruluklu dizilemeyi sağlar. Geri döndürülebilir olarak sonlandırılmış (reversibly terminated) floresan işaretli nükleotidler DNA sentezi sırasında tek tek eklenir, okunur ve ardından blokaj kaldırılarak sentez devam eder. DNA fragmanları, flow cell adı verilen özel bir cam yüzeye bağlanır. Flow cell üzerinde, DNA’nın bağlanmasını sağlayan adaptörler bulunur. DNA parçaları bu adaptörlere bağlandıktan sonra, köprüleme amplifikasyonu (bridge amplification) adı verilen işlem gerçekleştirilir. Bu süreçte, DNA molekülleri yüzeye bağlı kalarak kavisli bir yapı oluşturur ve kendini çoğaltır. Böylece her DNA fragmanından binlerce kopya üretilmiş olur. Bu amplifikasyon işlemi, dizileme sırasında sinyal gücünü artırarak yüksek hassasiyetle okuma yapılmasını sağlar ve DNA, dizilemeye hazır hale gelir.

   Dizileme aşamasında, DNA polimeraz enzimi, DNA’nın karşı zincirini sentezlemeye başlar. Bu süreçte, floresan işaretli ve geri döndürülebilir olarak sonlandırılmış (A, T, G, C) tek tek eklenir. Her nükleotid, lazerle taranarak okunur ve hangi bazın eklendiği tespit edilir. "Reversibly terminated fluorescent nucleotides" prensibi sayesinde, her nükleotid ekleme aşamasında DNA sentezi geçici olarak durdurulur böylece baz dizisi hassasiyetle tespit edilmektedir. Nükleotid okunduktan sonra, blokaj kaldırılarak bir sonraki nükleotidin eklenmesine izin verilir ve DNA sentezi devam eder. Bu yöntem, yüksek doğruluk sağlayarak DNA dizisinin adım adım belirlenmesini mümkün kılar. Aynı anda milyonlarca DNA fragmanı üzerinde gerçekleştirildiği için Illumina dizilemesi oldukça hızlı ve verimli bir dizileme yöntemidir (6).

   

   Şekil 3. (a) DNA fragmanları rastgele kesilerek oligonükleotid adaptörleri ile birleştirilir ve çift sarmallı hale getirilir. (b) DNA tek sarmallı hale getirilerek flow cell yüzeyindeki oligonükleotidlere bağlanır. Köprüleme amplifikasyonu ile DNA kümeleri oluşturulur. (c) Küme içindeki DNA zincirlerinden biri kesilerek dizileme için tek sarmallı şablon elde edilir. Çift yönlü dizileme için köprüleme tekrarlanır. (d) Uzun DNA parçalarının uçları biyotin ile işaretlenir, halkasal hale getirilir ve rastgele parçalanarak eşleşen uçlar dizileme için kullanılır (6).

   Illumina Dizilemenin Avantajları

   • Hızlı ve yüksek doğruluklu

   • Düşük maliyetli

   • Büyük veri üretme kapasitesi

   Illumina Dizilemenin Dezavantajları

   • Kısa okuma uzunlukları

   • Yüksek veri işleme gereksinimi

   
   

   3.2. Ion Torrent Dizileme

   Ion Torrent dizilemesinde, DNA fragmanları küçük manyetik boncuklara bağlanır ve emülsiyon PCR (emPCR) yöntemiyle çoğaltılır. Bu süreç, her DNA fragmanının birçok kopyasının üretilmesini sağlar ve dizileme işlemi sırasında daha güçlü bir sinyal elde edilmesine yardımcı olur.

   Dizileme aşamasında, DNA polimeraz enzimi, kalıp DNA zinciri üzerinde çalışarak her bir baz için uygun nükleotidi ekler. Her nükleotid eklenmesi sırasında hidrojen iyonu açığa çıkar ve bu iyonlar pH değişimine neden olur. Ion Torrent çipinde bulunan hassas yarı iletken sensörler, pH değişikliklerini ölçerek hangi nükleotidin eklendiğini tespit eder. Bu yöntem sayesinde, DNA dizisi elektriksel sinyaller üzerinden okunarak belirlenir (7).

   
   

   

   Şekil 4. Ion Torrent dizileme iş akışı (8).

   Ion Torrent Dizilemenin Avantajları

   • Optik sensörlere ihtiyaç duymadığı için dizileme süreci daha hızlıdır ve floresan bazlı teknolojilere göre maliyet açısından daha avantajlıdır.

   • Floresan etiketleme gibi ek kimyasal işlemler gerektirmediğinden dizileme süreci daha basittir.

   • Kompakt ve taşınabilir cihazlarla kullanılabilir bu da klinik ve saha araştırmaları için uygun olmasını sağlamaktadır.

   Ion Torrent Dizilemenin Dezavantajları

   • Uzun homopolimer dizilerinde (aynı bazın ardışık tekrar ettiği dizilerde) hata oranı yüksektir çünkü sensörler kaç bazın eklediğini bazen yanlış algılayabilir.

   • Büyük genom projeleri için Illumina veya PacBio gibi yöntemlere kıyasla daha düşük verim sunar.

   • Ölçeklenebilirliği sınırlıdır, büyük ölçekli genom analizlerinde çok fazla veri üretemez.

   
   

   3.3. SOLiD Dizileme

   SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) dizileme, ligasyon tabanlı bir yeni nesil dizileme (NGS) yöntemi olup özellikle yüksek doğruluk oranı ile dikkat çekmektedir. Life Technologies (şimdi Thermo Fisher Scientific) tarafından geliştirilen bu teknoloji, kısa okuma (short-read) dizileme kategorisine girer ve özellikle mutasyon tespiti ve hassas genom analizleri için kullanılır.

   SOLiD dizileme sürecinde, DNA fragmanları manyetik boncuklara bağlanır ve emülsiyon PCR (emPCR) yöntemiyle çoğaltılır. Bu sayede, her DNA fragmanından binlerce kopya oluşturularak sinyal gücü artırılır. Dizileme aşamasında, DNA fragmanları ligasyon enzimi yardımıyla floresan işaretli prob dizileri ile eşleştirilir ve hangi bazların dizildiği belirlenir. Bu yöntem, bir baz yerine iki bazın aynı anda okunmasını sağlayan "two-base encoding" sistemini kullanır böylece hata oranı önemli ölçüde azaltılır (9).

   

   Şekil 5. SOLiD dizileme ligasyon adımları. A) Dizileme, DNA primerinin kütüphane adaptörlerinden birine bağlandığı yüzeyde gerçekleşir. Di-baz probları, bağlanmak için yarışır; bağlandıktan sonra oktametin bir kısmı kesilir ve floresan sinyal yayılır. B) Genellikle 10 kez tekrarlanan ligasyon döngüleri sonunda farklı bazlar belirlenir. Bu süreç, primerin sıfırlanması ve tekrar eklenmesiyle, her bazın iki farklı reaksiyonda iki kez sorgulanmasını sağlar. C) Bu iki baz kodlama sistemi, DNA dizisinin doğru bir şekilde çözülmesini sağlayan özel bir matris kullanır (10).

   SOLiD Dizilemenin Avantajları

   • Çok yüksek doğruluk oranına sahiptir (%99.99'a kadar çıkabilir) bu nedenle mutasyon tespiti ve genom analizi için uygundur.

   • İki bazın aynı anda okunmasını sağlayan özel algoritma (two-base encoding) sayesinde hata oranı düşük tutulur.

   • Kanser araştırmaları, genetik varyasyon analizleri ve küçük genom dizilemeleri için oldukça etkilidir.

   SOLiD Dizilemenin Dezavantajları

   • Kısa okuma uzunlukları (50-75 bp) nedeniyle kompleks genom analizlerinde zorluk yaşanabilir.

   • Diğer NGS yöntemlerine göre veri analizi daha karmaşıktır.

   • Illumina gibi daha hızlı ve verimli yöntemlerin gelişmesiyle kullanımı azalmıştır.

   
   

   3.4. PacBio (SMRT) Dizileme

   PacBio dizileme, Single Molecule Real-Time (SMRT) sequencing adı verilen teknolojiye dayanan uzun okuma (long-read) dizileme yöntemlerinden biridir. Bu yöntem, DNA moleküllerini gerçek zamanlı olarak tek molekül seviyesinde dizileyerek büyük genomların dizilenmesinde, yapısal varyasyonların tespitinde ve epigenetik çalışmalarında kullanılmaktadır.

   PacBio dizilemesinde, DNA fragmanları SMRT hücreleri adı verilen özel kuyucuklara yüklenir. Bu kuyucuklarda, DNA polimeraz enzimi sentez sürecini başlatır ve floresan işaretli nükleotidler tek tek eklenerek dizileme gerçekleştirilir. Her bir nükleotid eklendiğinde, floresan sinyal yayar ve bu sinyal özel bir dedektör tarafından gerçek zamanlı olarak kaydedilir. Bu sayede DNA sentezi süreci doğrudan gözlemlenir ve dizileme sırasında hem baz sırası belirlenir hem de DNA'nın epigenetik modifikasyonları tespit edilebilir (11).

   
   

   

   Şekil 6. PacBio DNA Hazırlama İş Akışı (12).

   PacBio (SMRT) Dizilemenin Avantajları

   • Çok uzun okuma uzunlukları sağlar (10-100 kb arasında değişebilir) bu da büyük genom projeleri için idealdir.

   • Tek molekül dizileme prensibine dayandığı için PCR gerektirmez ve böylece amplifikasyon hatalarından kaçınılır.

   • Epigenetik değişiklikleri tespit edebilir.

   PacBio (SMRT) Dizilemenin Dezavantajları

   • Ham veri hata oranı diğer dizileme yöntemlerine göre biraz daha yüksektir ancak özel hata düzeltme algoritmaları (HiFi reads) ile bu hata oranı önemli ölçüde azaltılabilir.

   • Illumina gibi kısa okuma yöntemlerine göre maliyeti daha yüksektir ve veri üretme süresi daha uzundur.

   
   

   3.5. Nanopore Dizileme

   Nanopore dizileme, yeni nesil dizileme (NGS) teknolojilerinden biridir ve DNA ve RNA moleküllerinin doğrudan dizilenmesini sağlar. Oxford Nanopore Technologies (ONT) tarafından geliştirilen bu yöntem, diğer dizileme tekniklerinden farklı olarak optik algılama yerine elektriksel sinyal okuma prensibine dayanır. Bu yöntemde, biyolojik nanoporlardan oluşan bir membran kullanılarak DNA molekülleri elektrik alanı yardımıyla tek tek nanoporlardan geçirilir. Bu süreçte DNA, enzimler tarafından tek sarmallı hâle getirilir ve bir motor protein yardımıyla nanopordan belirli bir hızda geçirilir. DNA'nın nanopordan geçişi sırasında iyon akımında değişiklikler meydana gelir ve her bir beş baz uzunluğundaki (5-mer) dizilim, kendine özgü bir elektrik sinyali oluşturur. Bu sinyaller Metrichor (13) gibi biyoinformatik yazılımlar tarafından işlenerek DNA dizisine dönüştürülür (14).

   
   

   

   Şekil 7. Nanopore dizileme prensibi (15).

   Nanopore Dizilemenin Avantajları

   • Gerçek zamanlı dizileme yapabilir ve sonuçları anında verir.

   • Çok uzun DNA veya RNA dizilerini okuyabilir (50 kb veya daha uzun).

   • Kompakt ve taşınabilir cihazlarla (MinION) sahada kullanılabilir.

   Nanopore Dizilemenin Dezavantajları

   • Hata oranı Illumina gibi yöntemlere göre daha yüksektir.

   • Veri analizi için güçlü biyoinformatik araçlar gerektirir.

   • Sinyal değişimlerinden dolayı bazı bazların yanlış okunma riski vardır.

   
   

   DNA dizileme teknolojileri, genetik araştırmalardan klinik teşhislere kadar geniş bir kullanım alanına sahiptir. eski nesil dizileme yöntemleri, yüksek doğruluk oranlarıyla belirli genom bölgelerinin analizinde kullanılsa da Yeni Nesil Dizileme (NGS) yöntemleri sayesinde büyük ölçekli genom projeleri daha hızlı ve ekonomik bir şekilde tamamlanmaktadır. Kısa okuma yöntemleri daha düşük hata oranlarıyla hassas mutasyon tespitine olanak tanırken, uzun okuma teknolojileri büyük genom analizlerinde ve yapısal varyasyon tespitinde önemli rol oynamaktadır. Sonuç olarak, DNA dizileme teknolojileri hızla gelişmekte olup, tıbbi genetik, kişiselleştirilmiş tıp, tarım biyoteknolojisi ve adli bilimler gibi birçok alanda devrim yaratmaya devam etmektedir.

   
   
   
   
   
   

   REFERANSLAR

   1. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 Dec;74(12):5463-7. https://doi.org/10.1073/pnas.74.12.5463. 

   2. Estevezj, CC BY-SA 3.0 <https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0>, via Wikimedia Commons

   3. A.M. Maxam, & W. Gilbert. (1977). A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (2) 560-564, https://doi.org/10.1073/pnas.74.2.560 

   4. N, M., Kumar, P. S., & Manna, D. (2024). Chemical Methods to Identify Epigenetic Modifications in Cytosine Bases. Chemistry, an Asian journal, 19(3), e202301005. https://doi.org/10.1002/asia.202301005 

   5. Mardis ER. (2008). Next-generation DNA sequencing methods. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2008;9:387-402. https://doi.org/10.1146/annurev.genom.9.081307.164359 

   6. Bentley DR, Balasubramanian S, Swerdlow HP, Smith GP, Milton J, Brown CG, Hall KP, Evers DJ, Barnes CL, Bignell HR, Boutell JM, Bryant J, Carter RJ, Keira Cheetham R, Cox AJ, Ellis DJ, Flatbush MR, Gormley NA, Humphray SJ, Irving LJ, Karbelashvili MS, Kirk SM, Li H, Liu X, Maisinger KS, Murray LJ, Obradovic B, Ost T, Parkinson ML, Pratt MR, Rasolonjatovo IM, Reed MT, Rigatti R, Rodighiero C, Ross MT, Sabot A, Sankar SV, Scally A, Schroth GP, Smith ME, Smith VP, Spiridou A, Torrance PE, Tzonev SS, Vermaas EH, Walter K, Wu X, Zhang L, Alam MD, Anastasi C, Aniebo IC, Bailey DM, Bancarz IR, Banerjee S, Barbour SG, Baybayan PA, Benoit VA, Benson KF, Bevis C, Black PJ, Boodhun A, Brennan JS, Bridgham JA, Brown RC, Brown AA, Buermann DH, Bundu AA, Burrows JC, Carter NP, Castillo N, Chiara E Catenazzi M, Chang S, Neil Cooley R, Crake NR, Dada OO, Diakoumakos KD, Dominguez-Fernandez B, Earnshaw DJ, Egbujor UC, Elmore DW, Etchin SS, Ewan MR, Fedurco M, Fraser LJ, Fuentes Fajardo KV, Scott Furey W, George D, Gietzen KJ, Goddard CP, Golda GS, Granieri PA, Green DE, Gustafson DL, Hansen NF, Harnish K, Haudenschild CD, Heyer NI, Hims MM, Ho JT, Horgan AM, Hoschler K, Hurwitz S, Ivanov DV, Johnson MQ, James T, Huw Jones TA, Kang GD, Kerelska TH, Kersey AD, Khrebtukova I, Kindwall AP, Kingsbury Z, Kokko-Gonzales PI, Kumar A, Laurent MA, Lawley CT, Lee SE, Lee X, Liao AK, Loch JA, Lok M, Luo S, Mammen RM, Martin JW, McCauley PG, McNitt P, Mehta P, Moon KW, Mullens JW, Newington T, Ning Z, Ling Ng B, Novo SM, O'Neill MJ, Osborne MA, Osnowski A, Ostadan O, Paraschos LL, Pickering L, Pike AC, Pike AC, Chris Pinkard D, Pliskin DP, Podhasky J, Quijano VJ, Raczy C, Rae VH, Rawlings SR, Chiva Rodriguez A, Roe PM, Rogers J, Rogert Bacigalupo MC, Romanov N, Romieu A, Roth RK, Rourke NJ, Ruediger ST, Rusman E, Sanches-Kuiper RM, Schenker MR, Seoane JM, Shaw RJ, Shiver MK, Short SW, Sizto NL, Sluis JP, Smith MA, Ernest Sohna Sohna J, Spence EJ, Stevens K, Sutton N, Szajkowski L, Tregidgo CL, Turcatti G, Vandevondele S, Verhovsky Y, Virk SM, Wakelin S, Walcott GC, Wang J, Worsley GJ, Yan J, Yau L, Zuerlein M, Rogers J, Mullikin JC, Hurles ME, McCooke NJ, West JS, Oaks FL, Lundberg PL, Klenerman D, Durbin R, Smith AJ. (2008). Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. https://doi.org/10.1038/nature07517 

   7. Rothberg, J. M., Hinz, W., Rearick, T. M., Schultz, J., Mileski, W., Davey, M., Leamon, J. H., Johnson, K., Milgrew, M. J., Edwards, M., Hoon, J., Simons, J. F., Marran, D., Myers, J. W., Davidson, J. F., Branting, A., Nobile, J. R., Puc, B. P., Light, D., Clark, T. A., … Bustillo, J. (2011). An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. Nature, 475(7356), 348–352. https://doi.org/10.1038/nature10242 

   8. Golan, D., & Medvedev, P. (2013). Using state machines to model the Ion Torrent sequencing process and to improve read error rates. Bioinformatics (Oxford, England), 29(13), i344–i351. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt212 

   9. Liu, L., Li, Y., Li, S., Hu, N., He, Y., Pong, R., ... & Law, M. (2012). Comparison of next‐generation sequencing systems. BioMed research international, 2012(1), 251364. https://doi.org/10.1155/2012/251364

   10. Morey, M., Fernández-Marmiesse, A., Castiñeiras, D., Fraga, J. M., Couce, M. L., & Cocho, J. A. (2013). A glimpse into past, present, and future DNA sequencing. Molecular genetics and metabolism, 110(1-2), 3–24. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2013.04.024 

   11. Eid, J., Fehr, A., Gray, J., Luong, K., Lyle, J., Otto, G., Peluso, P., Rank, D., Baybayan, P., Bettman, B., Bibillo, A., Bjornson, K., Chaudhuri, B., Christians, F., Cicero, R., Clark, S., Dalal, R., Dewinter, A., Dixon, J., Foquet, M., … Turner, S. (2009). Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science (New York, N.Y.), 323(5910), 133–138. https://doi.org/10.1126/science.1162986 

   12. Kong, N., Ng, W., Thao, K. et al. Automation of PacBio SMRTbell NGS library preparation for bacterial genome sequencing. Stand in Genomic Sci 12, 27 (2017). https://doi.org/10.1186/s40793-017-0239-1 

   13. Oxford Nanopore Technologies. EPI2ME: Real-time data analysis for nanopore sequencing. Retrieved from https://nanoporetech.com/document/epi2me

   14. Jain, M., Fiddes, I. T., Miga, K. H., Olsen, H. E., Paten, B., & Akeson, M. (2015). Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer. Nature methods, 12(4), 351–356. https://doi.org/10.1038/nmeth.3290 

   15. Wang, Y., Zhao, Y., Bollas, A. et al. Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications. Nat Biotechnol 39, 1348–1365 (2021). https://doi.org/10.1038/s41587-021-01108-x