AMBER ile Moleküler Dinamik Simülasyonu: Uygulamalı Bir Rehber – Bölüm 1

AMBER, biyomoleküler simülasyonları gerçekleştirmeyi sağlayan yazılım paketinin adıdır. AMBER programının geliştirilmesi 1970'lerin sonlarında başlamıştır. AMBER, başlangıçta Peter Kollman'ın liderliğinde geliştirilmiş olup programın geliştirilme süreci şu anda aktif bir topluluk tarafından devam ettirilmektedir. "AMBER" teriminin iki anlamı bulunmaktadır. Bunlardan birincisi, biyomoleküllerin simülasyonu için kullanılan ve potansiyel enerjiyi hesaplamamızı sağlayan bir dizi moleküler mekanik kuvvet alanıdır. Bu kuvvet alanları kamuya açık olup çeşitli simülasyon programlarında kullanılmaktadır. AMBER terimi aynı zamanda program kodlarını içeren moleküler dinamik simülasyon yazılım paketinin de adıdır. AMBER yazılımı, AmberTools25 ve Amber24 (1) olmak üzere iki bölüm halinde dağıtılmaktadır. AmberTools25, tleap ve diğer programları içeren bir paket olup simülasyon öncesi moleküllerin hazırlanması ve düzenlenmesi için gereklidir. Amber24 ise biyomoleküler simülasyonları asıl yapan programın kendisidir.

Rehber kapsamında incelenecek protein yapısı: E.coli’ye Peptit metiyonin sülfoksit redüktaz proteini (PDB ID: 1FF3)

Bu enzim, protein yapılarında bulunan oksitlenmiş metiyonin rezidülerini indirgeyerek organizmaları oksidatif strese karşı korumaktadır. Enzimin kristal yapısı 1.9 Å çözünürlükle olup protein yapısında alfa heliks (sarmal) ve beta sheet (tabaka) yapıları göstermekte ve büyük oranda coil bölgeleri içermektedir. Katalitik mekanizmada görevli üç sisteinden Cys-51, çözünebilir ve korunmuş bir bölgede, bir alfa heliksin başlangıcında yer alır. Diğer iki sistein (Cys-198 ve Cys-206) C-terminal coil bölgesindedir ve kataliz için bu bölgenin hareketli olması gerekmektedir (2).

Bu rehber kapsamında, peptit metiyonin sülfoksit redüktaz’ın 30 nanosaniyelik (ns) için bir klasik moleküler dinamik (MD) simülasyonu protokolünden bahsedilecektir.

1. Adım: Simülasyon Öncesi Hazırlık

AMBER üzerinden simülasyona başlamadan önce, PDB ID’si 1FF3 olan peptit metiyonin sülfoksit redüktaz proteinin dosyası, Protein Data Bank’tan (3) aratılarak indirilir. Daha sonra proteine ait PDB dosyası BIOVIA Discovery Studio 2021 (4) moleküler görüntüleme programı üzerinden açılır. Proteinin A zinciri ve bu zincirin suları hariç diğer zincirleri ve onların suları ve SO4 gibi iyonlar program üzerinden silinir ve düzenlenmiş PDB dosyası kaydedilir.

Daha sonra bu düzenlenmiş PDB dosyası PyMOL (5) moleküler görüntüleme programı üzerinden açılır ve PyMOL’ün terminal (console) satırına çeşitli kodlar yazılarak modifiye edilmiş sistein içeren CAS atomları CYS olarak düzenlenir ve sisteinde olmayan atomlar (AS, CE1 ve CE2) silinir.

PyMOL’e girilmesi gereken kodlar:

> alter resn CAS, resn = "CYS"

Sonra, CYS de olmayan atomları silmek için:

# Sadece CYS'nin standart atomları

> standard_atoms = ["N", "CA", "C", "O", "CB", "SG"]

> cmd.select("bad_atoms", "resn CYS and not name " + "+".join(standard_atoms))

> cmd.remove("bad_atoms")

Daha sonra PyMOL’de düzenleme yaptıktan sonra bu düzenlenmiş PDB dosyası kaydedilir.

2. Adım: PKa Tespiti ve Protonasyon Belirleme:

pKa, bir asidin ayrışma sabiti olan Ka'nın on tabanında negatif logaritması olarak tanımlanmaktadır. Bu nedenle, pKa, bir molekülün çözeltide protonunu [H] ne kadar kolay verdiğinin ve dolayısıyla molekülün asitliğinin bir ölçüsüdür. Güçlü asitlerin pKa değeri küçüktür, zayıf asitlerin pKa değeri ise büyüktür (6). pKa değeri bir molekülün belirli bir pH koşulunda yüklü mü yoksa yüksüz mü olacağını belirlemektedir. “Protonasyon” ortamdaki H⁺ iyonlarının moleküle bağlanma sürecini ifade eder. Proteinler, amino asitlerden oluşmaktadır. Amino asitler, hem amino (-NH2) hem de karboksil (-COOH) fonksiyonel grubunu içeren organik moleküllerdir. Amino asitler farklı protonasyon durumlarında bulunabilmektedir. Bu durum özellikle proteinlerin ve nükleik asitlerin konformasyonel kararlılığı ile katalitik aktiviteleri üzerinde kritik bir rol oynamaktadır. Protein yapısında bulunan bir amino asit residülünün veya ligandın protonasyon durumu, kendi içinde bulunduğu çevrenin dielektrik özelliklerine ve komşu amino asit residülleriyle kurulan hidrojen bağlarına bağlı olarak lokal pH'tan sapabilmektedir (7).

PKa tespiti için PROPKA aracı (8) kullanılır. PyMOL’de düzenlenen PDB dosyası, bu siteye yüklenerek PKa hesabı gerçekleştirilir. PKa hesabı bu siteden yapılabileceği gibi eğer bilgisayarınızda Python yüklüyse ve PATH olarak tanımlandıysa propka3 programı üzerinden de aynı hesap yapılabilmektedir. propka3 programını yüklemek için bir terminal açılıp:

“pip install --upgrade propka”

Kodu yazılır ve böylelikle pip komutuyla propka3 programı yüklenmiş olur ve ardından terminale:

> propka3 proteinadı.pdb

Komutu girilerek propka3 programı çalıştırılır. Program “.pka” dosyası oluşturur ve bu dosyanın içerisinde proteine ait residülerin tahmini PKa değerleri bulunmaktadır.

Örneğin çalıştığımız peptit metiyonin sülfoksit redüktaz proteini için bu değerlerden bazıları:

Amino Asit	No.	Zincir	Tahmin Edilen pKa	Model pKa
ASP	4	A	4.34	3.80
ASP	89	A	3.21	3.80
ASP	101	A	2.70	3.80
ASP	165	A	1.87	3.80
GLU	43	A	4.97	4.50
GLU	94	A	8.20	4.50
GLU	154	A	4.67	4.50
GLU	210	A	4.77	4.50
C-Terminus	211	A	3.31	3.20
HIS	7	A	6.27	6.50
HIS	130	A	5.87	6.50
HIS	168	A	6.28	6.50
HIS	191	A	5.97	6.50
CYS	86	A	11.54	9.00
CYS	198	A	9.13	9.00
CYS	206	A	9.59	9.00
TYR	66	A	9.75	10.00
TYR	72	A	16.66	10.00
TYR	76	A	10.39	10.00
TYR	82	A	13.67	10.00
LYS	5	A	11.32	10.50
LYS	6	A	10.41	10.50
LYS	192	A	10.12	10.50
ARG	18	A	14.00	12.50
ARG	57	A	12.03	12.50
ARG	150	A	13.03	12.50
ARG	155	A	12.71	12.50
N-Terminus	1	A	7.70	8.00
Ligand (CYS SG)	-	A	15.22	10.00

Şeklinde bir tablo elde edilmektedir. Bu tabloda verilen pKa değerleri ve pH = 7 koşulu dikkate alınarak ilgili residülerin olası protonasyon durumları değerlendirilir.

Protonasyon analizinden sonra proteine ait PDB dosyası çalışma dizinine taşınır. Terminal üzerinden:

> pdb4amber -i protein.pdb -o düzenlenmiş.pdb 

kodu çalıştırılarak PDB dosyası AMBER‘in işleyebileceği bir formata dönüştürülür. Daha sonra PDB dosyasının içerisine girerek yapmış olduğumuz PKa analizine göre belli amino asit  residülerin protonasyon durumu ayarlanır.

3. Adım: Tleap.in Dosyası Oluşturma:

Çalışma dizininde terminal üzerinden:

> nano tleap.in

yazılarak tleap.in dosyası oluşturulur.

Bu dosyanın içerisine:

source leaprc.protein.ff14SB  !Protein kuvvet alanı

source leaprc.water.tip3p  !TİP3P su model

mol = loadpdb duzenlenmis.pdb  !Düzenlenmiş pdb dosyasını yüklemek için

solvatebox mol TIP3PBOX 10.0  !Sistemi suda çözmek için: TIP3P su modeli, 10 Å taşma payı

addions mol K+ 0  !Sistemi nötralize et

saveamberparm mol system.prmtop system.inpcrd  !Topoloji ve koordinat dosyalarını kaydet

savepdb mol system_leap_output.pdb

quit

değerleri yazılır. Daha sonra tleap.in dosyası kaydedilir ve terminalde:

> tleap -f tleap.in

Kodu yazılarak tleap çalıştırılır. Kod çalıştıktan sonra system_leap, output.pdb, system.prmtop ve system.inpcrd dosyaları bizim için önemlidir. System.prmtop topoloji dosyasıdır ve system_leap_output.pdb ise su kutusu oluşturulmuş ve iyon eklenmiş PDB dosyasıdır. System. inpcrd ise sistemdeki atomlara ait koordinat dosyasıdır.

Şekil 1. Protein çevresinde su kutusu oluşturulup iyonların eklenmesiyle oluşturulan simülasyon ortamı.

Referanslar

1. https://ambermd.org/ Erişim tarihi: 04.03.2026

2. Tête-Favier, F., Cobessi, D., Boschi-Muller, S., Azza, S., Branlant, G., & Aubry, A. (2000). Crystal structure of the Escherichia coli peptide methionine sulphoxide reductase at 1.9 A resolution. Structure (London, England : 1993), 8(11), 1167–1178. https://doi.org/10.1016/s0969-2126(00)00526-8

3. Burley, S. K., Berman, H. M., Kleywegt, G. J., Markley, J. L., Nakamura, H., & Velankar, S. (2017). Protein Data Bank (PDB): The Single Global Macromolecular Structure Archive. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 1607, 627–641. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7000-1_26

4. BIOVIA, Dassault Systèmes, BIOVIA Discovery Studio Visualizer, 2020, San Diego: Dassault Systèmes.

5. DeLano, W. L. (2002). The PyMOL molecular graphics system. http://www.pymol.org/.

6. https://bio.libretexts.org

7. Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2021). Lehninger Principles of Biochemistry. (8. Baskı). W. H. Freeman

8. Søndergaard, C. R., Olsson, M. H., Rostkowski, M., & Jensen, J. H. (2011). Improved Treatment of Ligands and Coupling Effects in Empirical Calculation and Rationalization of pKa Values. Journal of chemical theory and computation, 7(7), 2284–2295. https://doi.org/10.1021/ct200133y